蜱是专性吸血的节肢动物，寄生于两栖类、鸟类、爬行类和哺乳类等动物，部分种类可侵袭人，能够传播多种病原体而导致人类和动物疾病，对人类健康、畜牧业生产及野生动物都带来极大危害[1-2]。全世界现有蜱类900余种[3]，我国已报道2科9属124种蜱，103种蜱传病原体[4]，主要包括荆门蜱病毒（Jingmen tick virus）、阿龙山病毒（Alongshan virus）、松岭病毒（Songling virus）、湿地病毒（Wetland virus）、伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi）、无形体（Anaplasma spp.）、克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV）、贝纳柯克斯体（Coxiella burnetii）、土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）等[5-10]。
帕米尔高原地处中亚东南部，横跨塔吉克斯坦、中国和阿富汗，属大陆性高山气候，有广阔的牧场，宜农宜牧，是牦牛（Bos grunniens）、山羊（Capra hircus）、盘羊（Ovis ammon）、雪豹（Panthera uncia）、秃鹫（Aegypius monachus）、山鹑（Perdix perdix）、雉（Phasianus colchicus）、雪鸡（Tetraogallus tibetanus）和水禽等的繁育地，境内有众多湖泊和湿地[11-12]，生态环境适宜蜱类繁殖；新疆维吾尔自治区（新疆）塔什库尔干塔吉克自治县（塔什库尔干县）地处帕米尔高原东麓，毗邻塔吉克斯坦、巴基斯坦和阿富汗等国家，红旗拉甫口岸和卡拉苏口岸贸易、人员往来频繁[13]，有助于蜱类在各国之间间接扩散。塔什库尔干县有着丰富的旅游资源，全县建成5A级景区1家，4A级景区2家，2023年全县接待游客同比增长78.53%[14]，这将增加人类与蜱接触机会。随着帕米尔高原地区的社会经济发展，人类与蜱接触机会逐渐增多，但目前国内外尚无关于塔什库尔干县境内蜱类的相关研究。为了解新疆帕米尔高原地区蜱及其携带病原体的情况，本研究在塔什库尔干县5个区域采集蜱标本，通过形态学和分子生物学方法鉴定种类，并对常见蜱媒病原体进行检测和分析，以期为帕米尔高原蜱媒疾病监测、预警和防控提供参考。
1 材料与方法
1.1 蜱类采集
2024年4月下旬－5月中旬，在塔什库尔干县的斯如依沟（37°39′49″N，75°5′28″E）、提孜那甫乡（37°47′56″N，75°11′49″E）、金草滩湿地（38°1′8″N，75°12′13″E）、库克西鲁克乡（37°50′36″N，75°46′58″E）、盘龙古道（37°37′47″N，75°29′52″E）5个地点采集蜱标本，其中游离蜱采用布旗法仅于盘龙古道和斯如依沟的山地草原采集，采样点海拔3 800~4 300 m；所有寄生样本均在主人许可下采集，宿主为山羊。在寄生蜱样本中，有4只饱血蜱样本在冻存前产卵。所有样本皆置于含有75%乙醇和5%甘油的真空容器（Thermo Fisher，中国）中，并在液氮中保存。
1.2 蜱种鉴定
1.2.1 形态学鉴定
参考《中国经济昆虫志》（第三十九册）[15]，首先通过形态学对采集的蜱虫进行分类，主要为胫距革蜱（Dermacentor pavlovskyi）、丹氏血蜱（Haemaphysalis danieli）和具沟血蜱（H. sulcata）。其中胫距革蜱鉴别要点：须肢外缘圆弧形凸出，第2节背面后缘无刺；盾板背面有珐琅斑，且长大于宽；足胫节2~4和后跗节端部腹面有大刺，基节4无内距。丹氏血蜱鉴别要点：须肢棒形，外缘与内缘近乎平行，雌蜱齿式5|5（雄蜱4|4），基突粗短，足基节1、2内距窄长。具沟血蜱鉴别要点：须肢前窄后宽，第2节后外角中度凸出，第3节背面后缘无刺突，第2节腹面内缘刚毛粗大，窄叶状且紧密排列；基突粗短圆钝，基节4内距短钝。
1.2.2 分子生物学鉴定
表1 本研究采集蜱种类鉴定及其携带病原体PCR扩增的引物序列及反应条件Tab. 1 Primer sequences and reaction conditions for PCR amplification for tick species identification and pathogen detection |
| 目标物种 | 目标基因 | 引物序列（5′-3′） | 扩增序列长度（bp） | 反应条件 | 参考文献 |
| 蜱 | 16S rRNA基因 | Forward1：CTGCTCAATGATTTTTTAAATTGCTGTGG | 460 | 94 ℃5 min；92 ℃30 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，37个循环；72 ℃8 min | [16] |
| Reverse1：CCGGTCTGAACTCAGATCAAGT | |||||
| 巴贝虫 | SUU rRNA基因 | Forward1：GTCTTGTAATTGGAATGATGG | 450 | 94 ℃5 min；94 ℃45 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min，40个循环；72 ℃5 min | [17] |
| Reverse1：TAGTTTATGGTTAGGACTACG | |||||
| 无形体 | 16S rRNA基因 | Forward1：TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG | 450 | 94 ℃5 min；94 ℃45 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min，40个循环；72 ℃5 min | [18] |
| Reverse1：CACCTCTACACTAGGAATTCCGCTATC | |||||
| Forward2：TTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACG | |||||
| Reverse2：GTACCGTCATTATCTTCCCTA | |||||
| 贝纳柯克斯体 | com1 | Forward1：GCTGTTTCTGCCGAACGTAT | 526 | 94 ℃5 min；92 ℃30 s，56 ℃30 s，72 ℃30 s，37个循环；72 ℃5 min | [19] |
| Reverse1：AGACAACGCGGAGGTTTTTA | |||||
| 伯氏疏螺旋体 | 5S-23S rRNA基因 | Forward1：ACCATAGACTCTTATTACTTTGAC | 380 | 94 ℃5 min；92 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，37个循环；72 ℃5 min | [20] |
| Reverse1：TAAGCTGACTAATACTAATTACCC | |||||
| Forward2：ACCATAGACTCTTATTACTTTGACCA | 225 | 94 ℃5 min；92 ℃30 s，52 ℃30 s，72 ℃30 s，37个循环；72 ℃5 min | |||
| Reverse2：ACCATAGACTCTTACTTTGAC | |||||
| 马泰勒虫 | 18S rRNA基因 | Forward1：TTTGGGCTGTTTACAGTTGC | 531 | 94 ℃5 min；92 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃30 s，37个循环；72 ℃5 min | [21] |
| Reverse1：CTCAAAGTAAACGTCGAGTCATG |
注：SUU rRNA核糖体小亚基rRNA（ribosomal small subunit rRNA，SSU rRNA）。 |
1.3 病原体检测
样本前处理、具沟血蜱和丹氏血蜱分组见1.2.2。另有2只革蜱经形态学鉴定，单独封装为1份；4只产卵的母蜱，将全部的卵和母蜱清洗后，分别对应进行单独分装，共8份。所有样本均装至无菌2 ml离心管中，共计22份。
取分装好的蜱样本于1.5 ml无酶管中用液氮速冻并用研磨棒手动研磨，直至研磨成粉末状（无明显可见颗粒）。使用TIANamp基因组DNA试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取蜱基因组DNA。采用16S rRNA、SUU rRNA、com1、5S-23S rRNA和18S rRNA基因片段分别检测巴贝虫[17]、无形体[18]、贝纳柯克斯体[19]、伯氏疏螺旋体[20]和马泰勒虫（Theileria equi）[21]进行筛查（引物序列及反应条件见表 1）。PCR反应体系：2× Taq PLus Master Mix Ⅱ12.5 μl，正、反向引物各0.5 μl，基因组DNA 1 μl，双蒸水10.5 μl。以本实验室扩增的巴贝虫、牛无形体、贝纳柯克斯体、伯氏疏螺旋体和马泰勒虫基因片段为阳性对照。阴性对照采用双蒸馏水。PCR反应结束后，取5 μl PCR产物加入1.5%琼脂糖凝胶加样孔中进行电泳，凝胶成像分析系统下观察，出现目的条带产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行Sanger测序。
1.4 进化分析
测序结果利用基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）与GenBank中的参考序列进行比对。每个物种选取其中测序质量最高的结果，进一步基于MEGA Ⅹ软件，通过使用最大似然法和Tamura-Nei模型推断，显示对数似然值最高的树。相关分类群聚集在一起的树的百分比显示在分支旁边。启发式搜索的初始树通过BIONJ算法应用于使用Tamura-Nei模型估计的成对距离矩阵，然后选择对数似然值较高的拓扑来自动获得。自展值为1 000次。
2 结果
2.1 采获蜱种及数量
共采获蜱类1科2属3种396只，其中寄生蜱249只，游离蜱147只。寄生蜱和游离蜱优势度最大的均为丹氏血蜱，优势度（构成比）分别为61.85%（154/249）和76.19%（112/147），具沟血蜱次之，优势度分别为38.15%（95/249）和22.45%（33/147），2种血蜱均为寄生蜱和游离蜱的优势种；本次研究未在宿主体表采集到胫距革蜱，仅布旗法采获2只，占捕获蜱总数的1.36%（2/147）。在不同采集点，斯如依沟采获蜱数量最多，共采获雌蜱134只，雄蜱76只；盘龙古道最少，仅采获雌蜱8只，雄蜱6只。见表 2。
表2 新疆维吾尔自治区塔什库尔干塔吉克自治县蜱采样结果Tab. 2 Tick sampling results in Taxkorgan Tajik Autonomous County, Xinjiang Uygur Autonomous Region |
| 蜱种类 | 金草滩湿地 | 斯如依沟 | 提孜那甫 | 库克西鲁克 | 盘龙古道 | 总计 | |||||||||
| 雌 | 雄 | 雌 | 雄 | 雌 | 雄 | 雌 | 雄 | 雌 | 雄 | ||||||
| 寄生蜱 | |||||||||||||||
| 丹氏血蜱 | 17 | 4 | 27 | 5 | 69 | 11 | 18 | 3 | 0 | 0 | 154 | ||||
| 胫距革蜱 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | ||||
| 具沟血蜱 | 6 | 2 | 38 | 12 | 17 | 4 | 10 | 6 | 0 | 0 | 95 | ||||
| 游离蜱 | |||||||||||||||
| 丹氏血蜱 | 0 | 0 | 56 | 44 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7 | 5 | 112 | ||||
| 胫距革蜱 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 2 | ||||
| 具沟血蜱 | 0 | 2 | 13 | 15 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 33 | ||||
| 合计 | 23 | 8 | 134 | 76 | 86 | 15 | 31 | 9 | 8 | 6 | 396 | ||||
采获蜱种的序列上传GenBank数据库，构建系统发育树，结果显示，具沟血蜱（PQ439342）与来自中国新疆的具沟血蜱（OQ438073）同源性为99.28%；丹氏血蜱（PQ43801）与来自中国新疆的丹氏血蜱（MH394440）同源性为100%；胫距革蜱（PQ439710）与来自中国河北省的胫距革蜱（OK493294）同源性为99.3%。见图 1。
2.2 病原体检测
图2 基于16S rRNA基因的新疆维吾尔自治区塔什库尔干塔吉克自治县采获蜱中无形体最大似然法系统发育树注：◆本研究获得的牛无形体序列。 Fig. 2 Maximum likelihood-based phylogenetic tree of the 16S rRNA gene of Anaplasma in ticks collected from Taxkorgan Tajik Autonomous County, Xinjiang Uygur Autonomous Region, China |
所获序列上传GenBank，构建系统发育树，结果显示，本研究所获牛无形体（PQ449567）序列与来自中国吉林省的牛无形体（MH104642）序列同源性为98.98%；巴贝虫（PQ496495）与来自突尼斯的巴贝虫（KY885007）序列同源性为98.82%。
3 讨论
塔什库尔干县作为中国与中亚各国贸易往来的口岸和国内5A级景区帕米尔高原所在地，货物、人员往来频繁，是连接国内外货物、人员的重要枢纽。作为重要病媒生物之一的蜱及其传播疾病的防控对当地人民的健康和社会经济发展有重要影响。经查阅相关文献，本研究是国内外首次对塔什库尔干县的蜱种分布及其所携带病原体的调查。
已被证实的可以通过蜱媒传播的无形体有7种[27]。其中嗜吞噬细胞无形体（An. phagocytophilum）和山羊无形体（An. capra）通常被认为可引起人类疾病[28]。在2019年报告第1例病例前[29-30]，牛无形体最初被认为只是一种动物病原体。国内外研究人员在多种蜱中检测到该种无形体，其中包括缺角血蜱（H. inermi）、具尾扇头蜱（Rhipicephalus appendiculatus）、彩饰花蜱（Amblyomma variegatum）和截形璃眼蜱（Hyalomma truncaturn）[31]。蜱叮咬易感群体后，病原体随血液播散到被叮咬者全身各处，从而引发相应临床症状[32-33]。本研究在具沟血蜱和丹氏血蜱的寄生蜱及游离蜱样本中均检测到牛无形体；值得一提的是，在仅有的丹氏血蜱4份虫卵样本也均为阳性。这一发现为证实牛无形体的垂直传播提供了一定的证据，对今后在帕米尔高原地区该蜱种的重要宿主（如牛、羊、狗）和蜱的不同发育阶段开展牛无形体调查具有重要指导意义。
本文通过对帕米尔高原蜱的研究，对帕米尔高原地区蜱种类及其携带细菌性病原体和原虫情况有了初步的了解，但受限于高原地区较短的采样窗口期及课题组人员和经费，未能对骆驼、牛、绵羊等家畜和野生动物体表寄生的蜱虫进行系统调查，也未在蜱宿主动物和人群中开展病原学调查。此外，在实验分组时，未将雌蜱和雄蜱区分，致使后期结果不够全面，在未来的工作中将进一步调查相关内容，更加深入清楚地了解蜱传病原体在帕米尔高原地区的传播过程。随着“一带一路”建设的发展，物流及人员往来的快速增加，帕米尔高原地区的病媒生物监测及相关研究工作将在“健康中国”战略中发挥重要作用。
