革螨是指中气门亚目（Mesostigmata）革螨股（Gamasina）中的螨类[1]，呈世界性分布，已记录887属8 280种[2]。其中皮刺螨总科（Dermanyssoidea）的一些种类寄生于哺乳动物或鸟类体表及巢穴中，专性或兼性吸血，不仅可通过叮刺人的皮肤引起革螨性皮炎[3]，有些革螨还可作为立克次体痘、肾综合征出血热、地方性斑疹伤寒、鼠疫、森林脑炎、莱姆病、土拉菌病、Q热和钩端螺旋体病等多种人兽共患疾病的潜在传播媒介和贮藏宿主，威胁人和动物的健康。宏基因组测序技术可以获得病媒生物体内微生物群落构成[4]，包括可能致病种类。目前已利用高通量测序技术在蝙蝠体外寄生的6种巨刺螨（Macronyssidae）和7种蝠刺螨（Spinturnicidae）[5]、鸟类寄生的2种鼻刺螨（Rhinonyssidae）[6]和鸡皮刺螨（Dermanyssus gallinae）[7]以及蜂巢中寄生的狄斯瓦螨（Varroa destructor）[8]中开展细菌微生物研究，但尚未见鼠体寄生革螨体内微生物宏基因组研究的报道。本研究通过对采自鼠体表的耶氏厉螨（Laelaps jettmari Vitzthum，1930）的宏基因组测序，了解耶氏厉螨携带的微生物群落特征和携带的病原体种类，为探讨鼠体寄生革螨在传染病中的作用和传播风险提供依据。
1 材料与方法
1.1 样本采集
2023年10月在辽宁省丹东市凤城市农田、林地和湿地等生境利用鼠夹法捕鼠，梳理采集鼠体表寄生革螨，放入含0.9%生理盐水的冻存管中，1鼠1管，在干冰中运至实验室，保存于-80 ℃冰箱。
1.2 种类鉴定和分组
1.3 DNA提取
首先对收集的革螨标本进行清洗处理，去除螨体表面的细菌，革螨经75%乙醇溶液涮洗1次，置于一次性培养皿上，待酒精挥发后，用经酒精灯灼烧过的昆虫解剖针刺穿螨躯体后部，随后转移至QIAamp DNA Micro Kit（QIAGEN，德国）试剂盒的组织裂解液中，恒温金属浴振荡孵育24 h，按说明书提取DNA。
1.4 文库构建和测序
提取的DNA样本经Qubit 4.0（Thermo Fisher，美国）测定DNA浓度。检测合格的DNA样品使用Ultra Clean Universal Plus DNA Library Prep Kit for Illumina V3（UND637，南京诺唯赞，中国）试剂盒按照说明书完成宏基因测序文库，并加入索引代码（N34401，南京诺维赞，中国）以归属每个样品的序列。经Qubit 4.0检测浓度后送诺禾致源生物信息科技有限公司，用NovaSeq-PE150进行高通量测序。
1.5 数据分析
使用fastp v0.23.1软件对NovaSeq测序平台获得的原始数据（raw data）进行预处理，获取用于后续分析的有效数据（clean data）。使用MEGAHIT v1.2.9对质控后的有效数据进行组装分析。使用MetaGeneMark v1.2.9进行开放阅读框（open reading frame，ORF）预测。采用CD-HIT v4.5.8对ORF预测结果去冗余，并使用Bowtie v2.2.4比对获得用于后续分析的基因目录（gene catalogue），即非冗余数据库（unigenes）。使用DIAMOND v2.1.6进行物种注释。通过主坐标分析（principal coordinate analysis，PCoA）进行各样本细菌群落结构的比较分析，使用相似性分析（analysis of similarities，Anosim）非参数检验进行组间差异分析。
2 结果
3种生境共捕获黑线姬鼠（Apodemus agrarius）54只。从鼠体表共采集革螨143只，其中耶氏厉螨130只，占90.91%，为优势种。按生境代表性选取91只耶氏厉螨进行宏基因组测序。
2.1 宏基因组测序质控结果
本次测序共获得约111.82 GB下机数据，经质控过滤，有效数据中测序错误率 < 1.0%（Q20）和 < 0.1%（Q30）的碱基数目比例分别 > 95.00%和 > 90.00%，测序数据可靠性较高。见表 1。
表1 辽宁省丹东市凤城市采集的耶氏厉螨宏基因组测序数据质量统计Tab. 1 Quality statistics of metagenomic sequencing data of Laelaps jettmari collected from Fengcheng City, Dandong, Liaoning Province |
| 样本编号 | 革螨数量（只） | 原始数据总碱基数（G） | 有效数据总碱基数（G） | Q20（%） | Q30（%） | GC（%） | 有效数据比率（%） |
| G1-1 | 2 | 15.33 | 5.81 | 97.75 | 94.87 | 45.40 | 37.92 |
| G1-2 | 2 | 13.69 | 5.77 | 97.72 | 94.72 | 45.44 | 42.15 |
| G1-3 | 6 | 13.27 | 3.79 | 97.26 | 93.86 | 46.39 | 28.57 |
| G2-1 | 23 | 11.15 | 2.38 | 96.52 | 92.31 | 45.76 | 21.40 |
| G2-2 | 23 | 8.94 | 4.50 | 97.91 | 95.18 | 45.32 | 5.37 |
| G2-3 | 23 | 9.58 | 3.25 | 97.38 | 94.15 | 45.47 | 33.96 |
| G3-1 | 2 | 14.89 | 3.58 | 97.51 | 94.33 | 45.59 | 24.40 |
| G3-2 | 6 | 11.98 | 3.57 | 97.44 | 94.19 | 45.60 | 29.80 |
| G3-3 | 4 | 12.99 | 3.80 | 97.47 | 94.32 | 45.68 | 29.31 |
注：Q20表示质量 > 20的碱基占总数据量的比例；Q30表示质量 > 30的碱基占总数据量的比例；GC表示碱基G和C数量之和占总碱基数量的百分比；有效数据比率表示有效测序序列数占原始测序序列数的比例。 |
2.2 携带细菌的物种复杂度分析
9组耶氏厉螨样本的细菌物种丰富度和多样性情况见表 2，样本的ACE指数（abundance-based coverage estimator）为1 296.735±54.922，Chao1指数（Chao estimator 1）为1 306.152±53.576。香农-威纳指数（Shannon-Wiener index）为7.592±0.169，辛普森指数（Simpson index）为0.976±0.005。覆盖度（coverage）均 > 0.990。由图 1的泛基因组（pan-genome）的稀释曲线图可见，随着样本数量的增加，发现新基因的变化曲线趋于平缓，新基因的发现速度显著降低，大多数基因已经被发现进入，各样本当前的测序深度合适，可以满足后续的菌群结构及多样性分析。
表2 辽宁省丹东市凤城市采集的耶氏厉螨携带微生物的α多样性Tab. 2 Alpha diversity of microorganisms carried by Laelaps jettmari collected from Fengcheng City, Dandong, Liaoning Province |
| 样本编号 | ACE指数 | Chao1指数 | 香农-威纳指数 | 辛普森指数 | 覆盖度 |
| G1-1 | 1 358.737 | 1 367.607 | 7.672 | 0.979 | 0.999 |
| G1-2 | 1 257.652 | 1 265.027 | 7.506 | 0.977 | 1.000 |
| G1-3 | 1 236.403 | 1 249.270 | 7.677 | 0.978 | 0.999 |
| G2-1 | 1 393.139 | 1 391.598 | 7.518 | 0.969 | 0.999 |
| G2-2 | 1 308.144 | 1 329.553 | 7.694 | 0.979 | 0.999 |
| G2-3 | 1 296.259 | 1 303.412 | 7.198 | 0.966 | 0.999 |
| G3-1 | 1 239.179 | 1 244.766 | 7.710 | 0.979 | 0.999 |
| G3-2 | 1 324.508 | 1 338.140 | 7.744 | 0.979 | 0.999 |
| G3-3 | 1 256.591 | 1 266.000 | 7.606 | 0.976 | 1.000 |
注：ACE指数指abundance-based coverage estimator。 |
2.3 细菌群落结构及组成分析
通过与美国国家生物信息中心的非冗余蛋白质序列数据库（non-redundant proteins，NR）比对，选择细菌微生物序列用于微生物分析（因未在库中检索到适用于本研究的宿主基因组参考序列，且为了保证数据完整性，本研究未进行去宿主分析）。测序发现宿主比例占比较高，而获得微生物比例较小，其中未分类序列所占百分比平均约达97.00%，细菌仅占1.00%，其他为病毒（0.09%）、古菌（0.02%）等。细菌的Krona物种注释结果见图 2。
图2 辽宁省丹东市凤城市采集的耶氏厉螨宏基因组测序细菌Krona物种注释可视化结果注：K…a Klebsiella；S…a Salmonella；Uncl…d、U…d Unclassified，未分类的；V…e Vibrionaceae；Ps…es Pseudomonadales；X…s Xanthomonadales；C…m Clostridium；Clo…eae Clostridiaceae；FLavo…aceae Flavobacteriaceae；Flavo…iales Flavobacteriales；Cam…ota Campylobacterota；Camp…ales Campylobacterales；Ba…ta Bacillota；Acti…etes Actinomycetales；Cyan…ceae Cyanophyceae。 Fig. 2 Visualization results of Krona bacteria species annotation for metagenomic sequences of Laelaps jettmari collected from Fengcheng City, Dandong, Liaoning Province |
在门水平上，本次测序共注释到58个细菌门，丰度较高的前5位依次为假单胞菌门（Pseudomonadota）、厚壁菌门（Bacillota）、弯曲菌门（Campylobacterota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、放线菌门（Actinomycetota），约占总菌群的90.30%。在9组样本中，假单胞菌门均是优势菌门，相对丰度为65.11%~71.38%。见图 3A。
在纲水平上，共注释到65个菌纲，其中丰度较高的5个菌纲分别为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）、α-变形菌纲（Alphaproteobacteria）、ε-变形菌纲（Epsilonproteobacteria）、芽孢杆菌纲（Bacilli）、放线杆菌纲（Actinomycetes）。其中，γ-变形菌纲是优势菌纲，相对丰度为52.76%~66.20%，α-变形菌纲次之，相对丰度为6.01%~19.75%。见图 3B。
在属水平上，共注释到473个属，其中丰度较高的9个属分别是埃希菌属（Escherichia），硫杆菌属（Thiothrix）、不动杆菌属（Acinetobacter）、弯曲杆菌属（Campylobacter）、沙门菌属（Salmonella）、弧菌属（Vibrio）、克雷伯菌属（Klebsiella）、黄杆菌属（Flavobacterium）、梭菌属（Clostridium），其中，埃希菌属的丰度最高，9组样本的相对丰度分别为17.74%、16.54%、19.79%、25.54%、18.59%、23.55%、19.59%、21.43%、22.60%。除此之外，还注释到重要致病菌巴尔通体（Bartonella，0.58%）和共生菌，如沃尔巴克氏体（Wolbachia，1.66%）及微量的杀雄菌（Arsenophonus，0.01%）、弗朗西斯菌（Francisella，0.07%）、螺原体（Spiroplasma，0.31%）等。见图 3C。
在种水平上，共注释到814个种，大肠埃希菌（E. coli）是优势菌种，约占总菌群的19.17%，其次是硫杆菌（Thiothrix sp.，11.25%）、鲍曼不动杆菌（A. baumannii，9.60%）和空肠弯曲菌（Ca. jejuni，6.16%）。此外，还注释到一些常见的条件致病菌，如肠炎沙门菌（Sa. enterica，2.90%）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae，2.61%）、副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus，2.40%）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，0.48%），见图 3D。致病菌嗜吞噬细胞无形体（Anaplasma phagocytophilum，0.50%）也被检出，在各样本间分布均匀。但未注释到与已知病原体有关的立克次体（Rickettsia），仅注释到与库蠓（Culicoides newsteadi）有关的1种立克次体共生菌（Rickettsia endosymbiont of Culicoides newsteadi，0.04%）。
2.4 组间群落差异分析
分析3组革螨样本微生物群落结构的差异程度，基于Bray-Curtis距离绘制的主坐标分析图显示，3组9个样本间的微生物组成相似，其中第1轴贡献度为73.12%，第2轴贡献度为8.28%，见图 5。使用Anosim非参数检验分析样本间群落整体的相似性，不同生境革螨携带微生物群落结构差异均无统计学意义（农田-林地：R=0.111，P=0.300；农田-湿地：R=0.148，P=0.300；湿地-林地：R=0.148，P=0.300）。
3 讨论
皮刺螨总科中厉螨科（Laelapidae）、巨刺螨科和皮刺螨科（Dermanyssidae）的部分种类革螨可寄生于鼠体表或在鼠巢中营寄生生活，有机会被鼠类带入人的居室或工作场所，通过叮咬人的皮肤、吸血等引起皮肤丘疹、瘙痒等症状。此外，这些可叮咬人的革螨在吸血过程中可将病原体传播给人，成为疾病传播媒介。通过病原体的分离培养、一代测序和16S rRNA测序等方法，已经鉴定出革螨携带的多种病原体，如立克次体[11]、钩端螺旋体（Leptospira）[12]、汉坦病毒（Hantavirus）[13]、森林脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus）[14]等，说明革螨可能对人类和动物的健康构成潜在风险。与16S rRNA基因测序相比，宏基因组测序能鉴定微生物到种水平甚至菌株水平。这一优势也让其成为鉴定未知微生物、发现重要病原微生物的有效技术手段。但目前该技术在螨类中的研究仅限于鸡皮刺螨、瓦螨等危害养殖业的螨类。耶氏厉螨属于厉螨科厉螨属，是我国常见的鼠体寄生革螨，分布于我国南至广东省、北至黑龙江省的广大中东部地区，国外分布在日本至欧洲的广大区域。Wang等[15]通过模型预测耶氏厉螨可能分布在我国的1 046个县，覆盖5.17亿人口，是我国第二重要革螨。该螨的主要寄生宿主除农田主要害鼠黑线姬鼠外，还包括褐家鼠（Rattus norvegicus）、黄胸鼠（R. flavipectus）、小家鼠（Mus musculus）等20多种鼠类。耶氏厉螨可能侵袭在田间休息的人类，或被这些家栖鼠带入居室中在室内侵袭人类，从而将携带的病原体传播给人类。因此利用宏基因组技术研究耶氏厉螨携带微生物群落的构成和病原体种类，可以评估其在传染病流行中的潜在风险。
本研究发现耶氏厉螨与其他节肢动物一样，拥有独特且丰富的微生物群落。在门水平上，耶氏厉螨携带的微生物优势菌群为假单胞菌门、厚壁菌门、弯曲菌门。假单胞菌门曾称变形菌门（Proteobacteria），是细菌中最大的一门，包括多种病原菌，也是在本次测序中发现的丰度最高的细菌门类，其相对丰度范围为65.11%~71.38%。这与鸡皮刺螨[7]和蝠螨科、巨刺螨科[5]、鼻刺螨科的部分种类，及其他媒介生物如蜱[16]、蚤[7]、蚊[17]等中的研究结果一致，表明假单胞菌门中的大多数细菌广泛存在于节肢动物体内，其可能在维持节肢动物生命活动中具有一定的重要意义。其中的γ-变形菌纲是纲水平中相对丰度最高的类群，为52.76%~66.20%，且在9组样品中广泛、均匀分布。该结果与在巨刺螨[5]中的研究结果一致，提示该菌纲可能较广泛分布在部分革螨体内。但鼻刺螨科的Ptilonyssus chloris和蝠刺螨等革螨的优势菌纲则分别为β-变形菌纲和α-变形菌纲，可见不同类群的螨在纲水平的优势菌群存在一定差异。厉螨科中寄生于蜂巢的梅氏热厉螨（Tropilaelaps mercedesae）体内占比最高的细菌属是肠球菌属[18]，巨刺螨科中杀雄菌是其优势属，鸡皮刺螨（皮刺螨科）中葡萄球菌属占比较高，而耶氏厉螨中占比最高的属为埃希菌属，提示不同种类的螨具有其独特的菌群结构特征[19]。
本研究在耶氏厉螨中发现多种致病菌，包括克雷伯菌属、无形体属、不动杆菌属、沙门菌属、弯曲菌属、葡萄球菌属、巴尔通体属等。该螨宿主黑线姬鼠一直以来被认为是无形体、巴尔通体、钩端螺旋体等多种病原体的携带者和传染源[19-20]。而螨可能通过直接吸食携带病原体的宿主动物血液、接触受污染的宿主巢穴而间接感染病原体，并成为病原体的储藏宿主。在9组革螨样本中均检出了嗜吞噬细胞无形体，该菌是人粒细胞无形体病的病原体，通过蜱叮咬传播给人[21]，在巨刺螨科及蝠螨科的宏基因组研究中也曾检出过这一致病菌[5]，提示革螨可能是该病原体的潜在传播媒介。检出的鲍曼不动杆菌作为条件致病菌，可引发包括肺炎、血液感染和伤口感染等多种风险，是引起院内感染的主要病原体之一，肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）也是检出的可引起院内感染的重要条件致病菌。弯曲菌属的空肠弯曲菌和沙门菌属的肠炎沙门菌都是常见的食源性病原体，可以引起腹泻、发热和腹痛等。金黄色葡萄球菌可以引起皮肤和软组织感染等。除常见的致病菌外，大肠埃希菌以较高丰度广泛存在于革螨中，尽管一般不致病，但其致病株也是全球食物源性疾病的重要病原体，与多种严重疾病相关。
螨类可携带多种内共生菌。这些内共生菌可能对革螨本身或其宿主有益，与寄主建立共生互惠关系。如沃尔巴克氏体是在所有吸血节肢动物类群中皆有报道的一种共生菌[22]，该菌的存在对宿主昆虫等具有重要意义[23]，如参与多种宿主生殖调控[24]，因此被应用于控制虫媒及其体内虫媒病毒[25]。本次研究从耶氏厉螨中注释到沃尔巴克氏体的存在，作为其共生菌之一。此前已有10几种螨类如鸡皮刺螨[26]、胡瓜钝绥螨[27]（Neoseiulus cucumeris）、西方静走螨（Galendromus occidentalis）等也检出过该菌。这些在螨体内发现的沃尔巴克氏体被认为可能会与螨类宿主之间相互作用，影响其生殖和发育等[28]。立克次体一般被认为是多种人畜共患病的致病菌，如血红异皮螨（Allodermanyssus sanguineus）和柏氏禽刺螨（Ornithonyssus bacoti）通过叮刺吸血可以特异性传播小蛛立克次体（R. akari）[29]，引起人立克次体痘。耶氏厉螨也曾被检出携带着多种立克次体如R. helvetica、R. slovaca[30]。但另一方面，一些立克次体可以在非致病状态下与宿主形成共生关系。本研究中注释到1种与库蠓有关的立克次体共生菌。此外，还发现耶氏厉螨中存在着不同丰度的杀雄菌、弗朗西斯菌、螺原体等与吸血性节肢动物有关的初生共生菌[31]。这些共生菌为进一步研究其与宿主发育、繁殖和营养等多方面的关系奠定基础。
已有研究发现病媒生物所携带的菌群可能受到多种因素的影响，如蚤的种类及其性别、地区、气候等对其携带细菌群落的构成有显著影响[32]，微小扇头蜱（Rhipicephalus microplus）在不同性别和生长发育阶段携带的微生物群具有差异，但地域无明显的差异[33]。这些研究结果表明病媒生物携带的菌群受到多种复杂因素的影响，且病媒生物种类不同，影响效果可能存在差异。生境是螨及其宿主赖以生存的环境，决定了它们所接触环境的特点，影响其宿主鼠类的行为模式、活动范围。研究不同生境下革螨携带的病原体，可能会对理解其微生物群落、预测疾病发生风险及其在不同地理区域内的分布提供新的视角。本研究分析了农田、林地、湿地3种生境中的鼠体耶氏厉螨携带的微生物菌落结构，虽然林地微生物种数高于其余2种生境，但差异无统计学意义，可能与每组重复样本数较少有关。为更全面地揭示影响其携带菌群结构的复杂因素，应在更大范围采集不同宿主、不同季节、不同地区来源的样品开展研究。
本研究通过高通量测序技术对耶氏厉螨体内微生物群落的组成和多样性进行分析，获得该螨携带的菌群特征及其在不同生境的体现，发现了多种致病菌和共生菌，了解了生境变化对螨体内微生物群落结构的影响，为研究革螨在人类疾病传播、共生微生物对革螨生长发育影响以及鼠类宿主动物种群动态影响等方面提供了参考数据。
