按蚊属（Anopheles）昆虫是疟疾、丝虫病等重要虫媒传染病的传播媒介，全球已知约480种[1]，我国云南省边境口岸因湿热环境宜于蚊虫孳生，形成复杂的蚊种共存格局。带足按蚊（An. peditaeniatus）、雷氏按蚊（An. lesteri）、须喙按蚊（An. barbirostris）因地理分布高度重叠，形成复杂的生态位共存格局。传统鉴定依赖成蚊完整形态特征（如雄蚊尾器、雌蚊喙部鳞片），但口岸监测中大量幼蚊、蛹期及残缺成蚊样本常因关键鉴别特征缺失导致鉴定困难。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（cytochrome c oxidase subunit Ⅰ，COⅠ）基因作为DNA条形码标记，在近缘种鉴别中具有高分辨率优势，可用于揭示种群的遗传多样性、遗传分化、种群扩张特征及遗传距离与地理距离的相关性[2-3]。
本研究针对带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊三者分布重叠引发的鉴定困境，基于COⅠ基因建立三重PCR检测体系，旨在突破传统形态学鉴定对完整样本的依赖，为口岸病媒生物监测中复杂样本的快速精准鉴定提供分子生物学解决方案。
1 材料与方法
1.1 样本来源
本研究所用的9种蚊虫：带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊、美彩按蚊（An. splendidus）、多斑按蚊（An. maculatus）、乌头按蚊（An. aconitus）、克劳按蚊（An. crawfordi）、迷走按蚊（An. vagus）、棋斑按蚊（An. tessellatus），均为本实验室于云南省西双版纳傣族自治州勐腊县捕获。蚊种鉴定参考《中国国境口岸医学媒介生物鉴定图谱》[4]，已对鉴定结果复核。
表1 目标蚊种及对照组蚊虫所属亚属Tab. 1 Subgenera of target and control mosquito species |
| 所属亚属 | 目标蚊种 | 对照组蚊虫 |
| 按蚊亚属 | 带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊 | 克劳按蚊 |
| 塞蚊亚属 | 无 | 美彩按蚊、多斑按蚊、乌头按蚊、迷走按蚊、棋斑按蚊 |
1.2 仪器与试剂
蚊虫DNA模板提取试剂选用QIAGEN公司的DNeasy Blood and Tissue Kit；10×PCR buffer（无Mg2+）、MgCl2（25 mmol/L）、dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）、Taq酶（5 U/µl）购自TaKaRa公司；引物由上海Invitrogen公司合成；毛细管电泳仪为QIAGEN QIAxcel Advanced；PCR仪为QuantStudio 5。
1.3 DNA提取与模板制备
于生物安全柜内，取出保存在75%乙醇溶液中经过形态学鉴定的单只按蚊，按QIAGEN公司DNeasy Blood and Tissue Kit提取试剂盒说明书提取DNA，测定浓度，-20 ℃冻存备用。
1.4 引物设计
首先从GenBank获取带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊等靶标蚊虫及对照蚊种的线粒体COⅠ基因序列，利用Clustal Omega 1.2.2进行多序列比对，识别种间特异性变异区域；基于Primer3 Plus设定引物长度18~25 bp、Tm值55~60 ℃等参数，设计候选引物并通过OligoAnalyzer 3.1评估二级结构，经基于局部比对算法的搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）比对排除跨物种匹配引物；引物由上海Invitrogen公司合成，引物序列见表 2。
表2 3种按蚊种类鉴定引物序列及设计所依据的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因序列GenBank登录号Tab. 2 Primer sequences for the identification of three Anopheles species and their corresponding mitochondrial cytochrome c oxidase subunitⅠgene and GenBank accession numbers |
| 蚊种 | 编号 | 序列（5'-3'） | GenBank 登录号 | |
| 带足按蚊 | F1 | CAGCATGAGCAATTCCAGAT | MK685257.1 | |
| R1 | GCAGGAACAGGATGAACTG | |||
| F2 | GCTAAATCTACTGATGCTCCA | MK685257.1 | ||
| R2 | TTTATCCTCCTCTTTCATCTGG | |||
| F3 | AGCATGAGCAATTCCAGAT | MK685257.1 | ||
| R3 | GGCAGGAACAGGATGAAC | |||
| F4 | GCATGTGCTGTTACAATAAC | MK685257.1 | ||
| R4 | CTGGTGCTTTCATTGGAGA | |||
| F5 | GATGACCTAATTCAGCTCGA | MK685257.1 | ||
| R5 | GCCGGAATAGTAGGAACTTC | |||
| F6 | ATGACCTAATTCAGCTCGAA | MK685257.1 | ||
| R6 | AGCCGGAATAGTAGGAACT | |||
| 雷氏按蚊 | F7 | ATGTAATCCCTGGAGATCGTA | MK625000.1 | |
| R7 | ATCTGGAATTGCTCATGCT | |||
| F8 | GTAATCCCTGGAGATCGTATA | MK625000.1 | ||
| R8 | ATCTGGAATTGCTCATGCT | |||
| F9 | GTAATCCCTGGAGATCGTATA | MK625000.1 | ||
| R9 | TCATCTGGAATTGCTCATG | |||
| F10 | GCATGTGCTGTTACAATAAC | MK625000.1 | ||
| R10 | TGGAATTGCTCATGCTGG | |||
| F11 | TAATGTAATCCCTGGAGATCG | MK625000.1 | ||
| R11 | TGGAATTGCTCATGCTGG | |||
| F12 | AATCCCTGGAGATCGTATA | MK625000.1 | ||
| R12 | TCATCTGGAATTGCTCATG | |||
| 须喙按蚊 | F13 | GCTCCTGCTAATACTGGTAA | MK685250.1 | |
| R13 | GCTGGAACTGGATGAACT | |||
| F14 | GCTCCTGCTAATACTGGTAA | MK685250.1 | ||
| R14 | TGGAACTGGATGAACTGTTT | |||
| F15 | TGCTCCTGCTAATACTGGTA | MK685250.1 | ||
| R15 | GGAACTGGATGAACTGTTTATC | |||
| F16 | TTGCTCCTGCTAATACTGG | MK685250.1 | ||
| R16 | TGGAACTGGATGAACTGTTT | |||
| F17 | GCTCCTGCTAATACTGGTAA | MK685250.1 | ||
| R17 | CTGGAACTGGATGAACTGT | |||
| F18 | ATTGCTCCTGCTAATACTGG | MK685250.1 | ||
| R18 | GGAACTGGATGAACTGTTTATC |
1.5 特异性引物筛选
分别对每种蚊虫设计的6对引物进行单重PCR筛选，50 μl反应体系包含5 μl 10× buffer、3 μl 2.5 mmol/L dNTPs，3 μl 25 mmol/L MgCl2，1 μl 5U/μl Taq酶，正、反向引物各1 μl（50 pmol/μl），模板DNA（1 ng/μl）2 μl，补无菌水至50 μl。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃45 s，35个循环；72 ℃延伸10 min。电泳筛选条带清晰、无杂带的引物对。
1.6 三重PCR特异性试验
将筛选出的3对引物混合，采用单因素法优化引物浓度、模板DNA含量及退火温度。最优体系为：引物各1 μl（浓度为50 pmol/μl），模板DNA（1 ng/μl）各2 μl，其余成分同单重PCR。以9种蚊种DNA及无菌水为模板，验证方法特异性，毛细管电泳分析条带。
1.7 三重PCR敏感性试验
用紫外分光光度计对蚊虫DNA进行定量，调整浓度为10 ng/μl，再按10倍梯度稀释至10-6 ng/μl，共计8个浓度，按优化体系扩增，以清晰条带对应的最低浓度确定检测下限。
2 结果
2.1 特异性引物筛选
以带足按蚊基因组DNA为模板，使用6组引物（F1/R1~F6/R6）进行PCR扩增筛选，第5泳道（对应第3组引物F3/R3）扩增产生1条清晰、单一的条带，大小约为55 bp，无其余杂带，见图 1。
以雷氏按蚊基因组DNA为模板，使用6组引物（F7/R7~F12/R12）进行PCR扩增筛选，第3泳道（对应第8组引物F8/R8）扩增产生1条清晰、单一的条带，大小约为132 bp，无其余杂带，见图 2。
以须喙按蚊基因组DNA为模板，使用6组引物（F13/R13~F18/R18）进行PCR扩增筛选，第9泳道（对应第17组引物F17/R17）扩增产生1条清晰、单一的条带，大小约为250 bp，无其余杂带，见图 3。
2.2 三重PCR特异性试验
将筛选出的3对引物（F3/R3、F8/R8，、F17/R17）进行三重PCR体系的建立，优化反应条件，结果如图 4，带足按蚊出现55 bp的特异性条带，雷氏按蚊出现132 bp特异性条带，须喙按蚊出现250 bp特异性条带，美彩按蚊、多斑按蚊、乌头按蚊、克劳按蚊、迷糊按蚊、棋斑按蚊及无菌双蒸水结果均无条带。同一蚊种不同个体的重复性试验结果均一致。
2.3 三重PCR敏感性试验
将带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的模板DNA 10倍梯度稀释后进行多重PCR检测，结果3种按蚊检测下限一致，均为10-4 ng/μl，见图 5。
3 讨论
现阶段对按蚊的鉴定，主要依靠形态学鉴定，对于残缺样本和非成虫期的样本，形态学鉴定困难。本文涉及的带足按蚊和雷氏按蚊同属于赫坎按蚊种团，该种团在形态结构上很类似，以传统的形态学分类方法很难进行准确区分，存在众多隐种，部分成员种几乎无法从形态学层面进行准确鉴别[12-13]。本研究首先根据带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊的保守序列，分别设计6对引物进行COⅠ基因序列扩增，在引物筛选中分别发现第3组、第8组、第17组引物可分别扩增出55、132和250 bp的特异性条带，适用于残缺、非成虫期等带足按蚊、雷氏按蚊、须喙按蚊样本的扩增。Rudolf等[14]研究表明即使很短的DNA片段也能有效地用于物种识别。与彭恒等[15]利用多重PCR鉴别赫坎按蚊种团成员的研究相比，本体系进一步整合跨亚属近缘种（须喙按蚊与赫坎种团）的同步鉴定，拓宽了应用场景。
本研究与梁秋果等[3]使用COⅠ基因进行中华按蚊地理种群区分的结果一致，显示了COⅠ基因在按蚊种群遗传分析中表现出的高分辨率。康泽辉等[2]研究表明线粒体基因组作为DNA条形码开展分子鉴定具有突出优势，其中COⅠ基因在动物界中具有高度的保守性和足够的变异度，适用于物种水平的鉴定。本文基于COⅠ基因建立带足按蚊、雷氏按蚊和须喙按蚊三重PCR鉴定方法，筛选出的3对引物可扩增目的基因，且未出现其他近似蚊种DNA模板扩增，彼此无交叉反应，特异性强。通过对该方法的敏感性试验，可见其检测下限为10-4 ng/μl，证实该检测方法具有良好的稳定性和可靠性，适用于3种目标按蚊样本的快速鉴定，为口岸病媒生物鉴定提供了高效的分子生物学手段。下一步可验证该方法对形态不完整和非成虫期标本的鉴定准确性。