发热伴血小板减少综合征（severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是我国发现的一种由发热伴血小板减少综合征病毒（severe fever with thrombocytopenia syndrome phlebovirus，SFTSV）引起的以高热、恶心呕吐、血小板和白细胞减少为症状的新型传染病，通常起病急，病情发展迅速，严重者多因多器官功能衰竭而死，该病发现初期病死率高达30%[1]。SFTS病例广泛分布于中国的多个省份，主要在东部、中部和东北部的山区和丘陵地带的农村，近年来陆续在日本、韩国和美国等地也有报道[2]。SFTS发病率的持续上升及其病媒在全球范围内的迅速传播，预示着该疾病具有引起大规模流行的风险，为全球公共卫生安全带来了巨大挑战[3]。SFTSV现更名为大别班达病毒（Dabie bandavirus，DBV），其主要传播方式为蜱叮咬，也能在人与人之间经血液或黏膜接触传播[4]。病毒颗粒呈球形，有包膜，基因组由L（大）、M（中）、S（小）3个单股负链RNA片段组成，分别含6 368、3 378和1 744个核苷酸，分别编码RNA依赖的RNA聚合酶、糖蛋白、核蛋白（nucleoprotein，NP）和非结构蛋白（nonstructural protein，NSs）。基于DBV 3个基因片段的系统发育分析表明，当前流行株划分为A~F 6种不同基因型，每种型别的分子特征和主要流行地区不同[5]。
1 材料与方法
1.1 资料和标本来源
病例资料来自中国疾病预防控制信息系统和个案调查报告。结合临床特征和流行病学调查情况，绍兴市医疗机构采集SFTS疑似病例发病急性期静脉血标本5 ml，专业人员按照生物安全管理要求转运至绍兴市或各县（区、市）疾病预防控制中心（疾控中心）实验室，实验室人员接收样本后进行即时检测，将核酸检测阳性样本于-80 ℃冰箱保存。
1.2 仪器与器材
全自动核酸提取仪（江苏硕世生物科技股份有限公司，型号：SSNP-2000B）；荧光定量PCR仪（美国ABI，型号：ViiA7）；生物安全柜（新加坡ESCO，型号：LA2-3A1）；核酸快速提取试剂盒（江苏硕世生物科技股份有限公司，批号：20230200，货号：SDKF60101）；一步法RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa，批号：AL52324A/ALF2392A/AL52332A，货号：RR064A）；引物、探针来自浙江省疾控中心。
1.3 方法
1.3.1 核酸提取
将全血样本离心，取200 μl血清加入到提取核酸的预封装试剂盒中，全自动核酸提取仪利用磁珠吸附原理，自动完成核酸提取和纯化。
1.3.2 实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测
使用qPCR试剂以及DBV的特异性引物探针，按说明书加入各组分配置反应体系共15 μl，加入提取的核酸10 μl。反应条件：45 ℃ 10 min；95 ℃ 10 min；94 ℃ 15 s，51 ℃ 45 s，40个循环。结果按试剂盒说明书进行判读。
1.3.3 基因测序及系统发育分析
将循环阈值（cycle threshold，Ct）≤30的血清标本送到上海伯杰医疗科技股份有限公司，应用一代测序技术对DBV的S基因片段进行序列测定，扩增引物参考文献[8]，采用Clustal Omega线上多序列分析工具（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对测序成功的DBV-S基因片段的核苷酸序列进行多重比对，分析多条序列核苷酸之间的同源性。从GenBank中下载DBV参考序列的S片段全长序列，对测序成功的毒株进行遗传进化分析，使用MEGA11.0软件通过Cluster W法对序列进行比对，邻接法构建系统进化树，选择自举法（Bootstrap）进行检验，使用1 000次引导复制来确定分支节点处指示的可靠性值。。
1.3.4 氨基酸序列变异位点分析
根据S片段基因的核苷酸序列得出相应的NP、NSs氨基酸序列，使用DNAStar 11.1软件包中的Megalign工具对所有氨基酸序列进行比对，分析流行株的氨基酸位点变异情况。
1.4 统计学分析
采用Excel 2010软件整理数据，SPSS 22.0软件和Fisher确切概率法比较不同型别DBV的地区分布以及不同型别DBV感染病例的病死率差异，P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 流行情况
2023年绍兴市累计报告SFTS 102例，其中死亡13例，病死率达12.75%。全市在3－10月均有病例报告，病例发病时间主要集中在4－8月，以4月和5月最多，分别有27和21例，合计占47.06%。病例主要来自新昌县（61例），占全市总病例的59.80%，其他5个县（区、市）也均有病例分布，嵊州市、上虞区、诸暨市、柯桥区和越城区分别有16、12、7、5和1例。全市SFTS病例中男性46例，女性56例，男女性别比为1∶1.22；年龄最小14岁，最大96岁，以60~ < 70（31例）、70~ < 80岁（33例）2个年龄段为主，二者合计占所有病例的62.75%，其次为50~ < 60岁年龄段（19例，18.63%），0~ < 40、40~ < 50、80~ < 90、≥90岁年龄组分别有6、4、5、4例；报告病例职业以农民（79例，77.45%）为主，其次是工人（9例）。见表 1。
表1 2023年浙江省绍兴市发热伴血小板减少综合征病例的三间分布Tab. 1 Time, region, and population distributions of severe fever with thrombocytopenia syndrome cases in Shaoxing, Zhejiang Province, 2023 |
| 分组 | 病例数（例） | 构成比（%） | 分组 | 病例数（例） | 构成比（%） | |
| 性别 | 发病时间（月） | |||||
| 男性 | 46 | 45.10 | 3 | 3 | 2.94 | |
| 女性 | 56 | 54.90 | 4 | 27 | 26.47 | |
| 年龄（岁） | 5 | 21 | 20.59 | |||
| 0~ < 40 | 6 | 5.88 | 6 | 17 | 16.67 | |
| 40~ < 50 | 4 | 3.92 | 7 | 15 | 14.71 | |
| 50~ < 60 | 19 | 18.63 | 8 | 11 | 10.78 | |
| 60~ < 70 | 31 | 30.39 | 9 | 5 | 4.90 | |
| 70~ < 80 | 33 | 32.36 | 10 | 3 | 2.94 | |
| 80~ < 90 | 5 | 4.90 | 地区 | |||
| ≥90 | 4 | 3.92 | 新昌县 | 61 | 59.80 | |
| 职业 | 嵊州市 | 16 | 15.69 | |||
| 农民 | 79 | 77.45 | 上虞区 | 12 | 11.77 | |
| 工人 | 9 | 8.83 | 诸暨市 | 7 | 6.86 | |
| 离退人员 | 4 | 3.92 | 柯桥区 | 5 | 4.90 | |
| 干部职员 | 3 | 2.94 | 越城区 | 1 | 0.98 | |
| 其他 | 7 | 6.86 |
2.2 DBV-S基因片段序列的遗传进化分析
通过一代测序成功获得16株DBV的S基因片段序列，多序列比对结果表明16例S基因片段之间核苷酸同源性为94.27%~100%。将测序成功的S基因片段与不同基因型参考序列进行遗传进化分析，系统进化树显示绍兴地区16株DBV中包含3种基因型，C型3株，F型5株，E型8株。进一步分析DBV所属亚型，结果显示8株E型DBV均属于E-3亚型，与宁波市流行株形成1个分支，而5株F型DBV中有4株属于F-2型，与日本、韩国株属于同一分支，另外1株属于F-1亚型，也和宁波株属于同一分支。见图 1。
2.3 不同型别DBV的地区分布和病例临床结局
3株C型（2023SX02、2023SX11、2023SX13）DBV全部来源于上虞区，而8株E型分布范围广，除嵊州市、越城区外的4个县（市、区）均有分布，另外F型中4株来自于新昌县，1株来自于柯桥区，见图 2。使用Fisher确切概率法检验不同基因型DBV的地区分布差异，结果显示，C型与F型毒株的地区分布差异有统计学意义（P=0.018），C型与E型、E型与F型毒株地区分布差异均无统计学意义（均P > 0.05）。16株DBV来源的病例中有4例死亡，其中E型3例，F型1例，经Fisher确切概率法检验，3种型别感染病例的病死率差异均无统计学意义（均P > 0.05）。
2.4 氨基酸变异分析
绍兴市流行株和参考株的NP、NSs氨基酸同源性分别为98.40%~100%和94.50%~100%。进一步比对发现，在9株DBV流行株中，存在与所有参考株均不相同的位点，NP、NSs分别有5个和18个氨基酸变异位点，占所有氨基酸的0.13%和0.38%。见表 2。
表2 2023年浙江省绍兴市16株大别班达病毒核蛋白和非结构蛋白的氨基酸变异位点Tab. 2 Amino acid variation sites of nucleoprotein and nonstructural protein of 16 Dabie bandavirus strains from Shaoxing, Zhejiang Province, 2023 |
| 基因型 | 毒株编号 | 氨基酸变异位点 | |
| NP | NSs | ||
| C | 2023SX02 | D215E、F266Y | |
| C | 2023SX11 | T162A | D215E、F266Y |
| C | 2023SX13 | V237A | F266Y、T272I |
| E-3 | 2023SX04 | K136R | |
| E-3 | 2023SX05 | K136R | |
| E-3 | 2023SX07 | K136R | |
| E-3 | 2023SX08 | E78V、L81E、D82H、M83V、E127K、L181Q、A184V、L186P、Q187R | |
| E-3 | 2023SX15 | L77I、D87G | |
| F-2 | 2023SX06 | C258Y | |
注：T苏氨酸；A丙氨酸；V缬氨酸；K赖氨酸；R精氨酸；D天冬氨酸；E谷氨酸；F苯丙氨酸；Y酪氨酸；T苏氨酸；I异亮氨酸；L亮氨酸；H组氨酸；M蛋氨酸；K赖氨酸；Q谷氨酰胺；P脯氨酸；G甘氨酸；C半胱氨酸。 |
3 讨论
浙江省自2011年首次报道SFTS病例以来，绍兴市每年的发病数始终保持在个位数水平，2015－2019年共报道15例[7]，2020年6月至2022年10月报告了9例[9]，而2023年报告发病数突增，达到102例，引起高度关注。研究表明SFTS不仅通过蜱叮咬传播，也经常在家庭及医院环境中发生人际传播[10-11]。绍兴市短期内病例数量显著增多的现象，可能的原因在于，一是2020－2022年新型冠状病毒感染疫情（新冠疫情）期间管控措施的实施使得空气质量和水质改善，许多野生动物和鸟类的繁殖地分布发生变化，活动范围扩大，甚至延伸到道路、城市和其他人类居住区域[12]，进而使得寄生于这些动物体表的蜱及其携带的病毒传播范围更广；二是自2022年底新冠疫情人流管控措施放宽后，公众逐渐放松了防疫警惕，不再普遍佩戴口罩和保持社交距离，同时外出参与农业劳作活动的频次上升，与蜱等媒介生物接触的机会增多，感染病毒风险增加。2023年病死率为12.75%，高于全国近年平均病死率5.13%[13]和浙江省2021年病死率8.24%[14]。发病时间集中在4－8月，呈现出明显的夏秋季高发趋势，主要原因是该时段蜱密度升高以及人们穿着较少、皮肤暴露增加。
SFTS流行与当地的环境或气候条件密切相关，多数病例集中在新昌县，该地山区和丘陵面积较大，具有典型山地气候特征条件，适合蜱等媒介生物的生长繁殖，且新昌县毗邻浙江省SFTS发病率较高的临海市、天台县、三门县和宁海县，均位于天台山脉一带区域，各地区空间距离短，蜱及其宿主动物容易在这些地区之间频繁活动和迁移，为病毒的传播提供便利条件。老年农民，尤其是女性，是SFTS的易感人群，本研究结果也进一步证实了此现象，确诊的60~ < 80年龄段老年人中，95%（61/64）以上为农民，多数人经常进行采摘、除草等农业活动，但通常免疫力较弱，感染后易发病且症状较重，亟需加强这类高危人群的健康宣传，加大传播媒介和宿主动物的监测力度，以有效控制和降低发病率。
关于DBV基因分型目前尚无统一标准，2021年中国疾病预防控制中心使用294条L基因、304条M基因和504条S基因全长序列数据集将病毒基因分为A~F 6个基因型，其中浙江省以F型为主，其次是E型[5]，还有研究将韩国DBV流行的主要基因型进一步细化为多个亚型[15-16]。本研究参考这些分型体系对绍兴市流行株进行遗传进化分析，发现绍兴市DBV的S片段基因型大部分属于浙江省优势型E和F型，和宁波株、日本和韩国株亲缘关系较近，和以往报道中浙江株与日本、韩国株分子遗传距离较近的结果一致[17-19]。另外还有3株浙江省较少见的C型，且F型中存在F-2和F-1两种亚型，提示各流行株S片段有明显的进化差异，绍兴地区DBV具有丰富的遗传多样性。
从地理分布来看，主要流行型别E和F型在绍兴地区的分布无明显的地域差异，广泛分布于市内各个区及其他县（市）。而值得注意的是，C型流行株表现出特定的地域集中特征，都分布在上虞区，据报道，C型较为少见，且主要分布区域为江苏和山东省一带[20]，而在绍兴地区出现并表现出特殊分布模式，其原因考虑是鸟类等动物宿主迁徙传播至此，或者外地携带病毒人群的输入，进而使得C型病毒在一定地域范围内扩散。病毒基因型的不同可能是造成不同流行区SFTS病死率差异的原因[21]，研究发现F基因型DBV具有比其他基因型更高的病死率[20]，本研究中感染不同型别DBV病例的病死率无统计学差异，需扩大样本量进一步研究。影响病例病死率的因素十分复杂，不同基因型对感染者致死率的影响是一个值得关注和深入探讨的问题。分节段RNA病毒的基因重组是导致其遗传多样性的重要机制，DBV可由于不断突变和重配而迅速进化，浙江株中存在较多的重配体[5, 22]，本次未对3个片段进行全基因组分析，但绍兴市多种基因型的存在提示基因重配的可能，因此持续开展病原体监测和基因测序分析，关注其序列变异情况具有重要意义。
S基因片段编码NP和NSs，分别参与介导病毒核糖核蛋白复合物的形成和抑制宿主先天抗病毒免疫反应[23-24]，研究表明，某些关键位点的氨基酸对蛋白质发挥其生物功能起着至关重要的作用，如NSs的21和23位的2个保守氨基酸是抑制宿主干扰素反应所必需的[25]，NSs的W61Y突变会使NSs-NP相互作用和病毒复制减少[26-27]。本研究通过对氨基酸位点的对比分析，发现尽管所有毒株的同源性较高，但流行株也存在不少变异位点，许多位点突变仅出现于单一病毒株中，但也存在同一型别病毒株有相同变异位点的现象，如C型毒株的F266Y、D215E和E型毒株的K136R，这些变异是否具有型别特异性以及对病原体的生物学特性改变是否存在影响还需进一步探究。E型毒株2023SX08的NSs含有较多变异位点，且主要集中在位点78~83、181~187两块短肽区域，该毒株的特殊性也同样值得关注。
综上所述，本研究通过开展DBV的监测和基因测序工作，明确了绍兴市2023年SFTS的流行特点和DBV在本地的基因型分布情况，初步探索了病毒的分子变异趋势，为后续深入研究其动态演变规律、进化模式及防控策略的制定奠定了坚实基础。本研究也存在不足之处，未对病毒滴度较低的样本进行分离培养，导致部分核酸检测阳性样本的基因序列未获取到，以及未结合病例临床数据探讨不同型别的病毒与疾病的严重程度、临床表现之间的关系，将在后续的工作中进行深入研究。